[ziuw]

Anthrax -(Şarbon)
Laboratuvar Tanı Notları

İnceleme örneği:
Hasta hayvandan : kan, ödem sıvısı
Ölü hayvandan : dalak!!!!, ve diğer iç organlar

1-BAKTERİOSKOPİ
Şarbon, veteriner mikrobiyolojide bakterioskopinin önemli olduğu üç hastalıktan biridir. B. anthracis invivo koşullarda kapsüllüdür. Bunu saptamak için gelen inceleme örneğinden mutlaka GİEMSA BOYAMA yapılması gereklidir. Ayrıca etkenin Gram özelliğini de belirlemek amacıyla Gram boyamanın da yapılması gerekmektedir.
Gram boyama
Anthrax şüphesi ile laboratuvara gönderilen örnekler Gram ve Giemsa boyama yöntemleri ile boyanırlar. Gram boyama sonucunda tek tek ya da 3-8 basilden oluşan zincirler şeklinde Gram pozitif basiller görülür.
Giemsa boyama
Preparat hazırlanır, kurutulur, metil alkol ile tesbit edilir. Üzerine Giemsa boyası dökülür ve 30 dakika beklenir.Distile su ile yıkanır, immersiyon yağı damlatılarak mikroskopta incelenir.
Basilin kendisi koyu mavi/mor renkte görünür. Pembe renkte boyanmış kapsülün basili çepeçevre sardığı gözlenir.
2-KÜLTÜR
İnceleme örneğinden kanlı agara ekim yapılır. 37 ºC de 24 saat süreyle ve aerobik koşullarda inkubasyona bırakılır. İnkubasyon süresi sonunda öncelikle makroskobik inceleme yapılır. B. anthracis, kanlı agarda 3-5 mm çapında gri ve kenarları çentikli (R-tipi) koloniler oluşturur. Şüpheli kolonilerden Gram boyama ve spor boyama yapılır.
Gram boyamanın amacı etkenin Gram özelliğini saptamak ve aynı zamanda kültürün saf olup olmadığını anlamaktır. Kolonilerden yapılan Gram boyama sonucunda etken, saç gibi uzun flamentler şeklinde görülür.
Vejetatif formdaki B. anthracis vücut dışında (invitro) spor formuna dönüşür. Spor formunun saptanması için kültürlerden mutlaka SPOR BOYAMA yapılması gerekmektedir.
Spor boyama
Preparat hazırlanır, kurutulur ve tesbit edilir. Üzerine malasit yeşili dökülür. 3-5 dakika süre ile alttan ısıtılarak, sporların boyayı alması sağlanır. Preparat suyla yıkanır. Karşıt boya olarak sulu fuksin ile 30 saniye boyanır. Suyla yıkanır, immersiyon yaı damlatılır ve mikroskopta incelenir.
Sporlar yeşil renkte görülür.
Bu aşamadan sonra inceleme örneğinden izole edilen etkenin identifikasyonuna geçilir. Burada özellikle etkenin diğer anthrakoidlerden ayrımının yapılması gerekmektedir. Aşağıdaki özelliklerin saptanması ile etkenin identifikasyonu yapılabilmektedir:
A-Kapsül formasyonu
B. anthracis invivo koşullarda kapsüllüdür. Şüpheli kolonilerden hazırlanan emülsiyonlardan farelere intraperitonal inokule edildikten 6-8 saat sonra periton sıvısından preparat hazırlanıp, Giemsa ile boyandığında kapsüllü basiller görülür. Antrakoidlerde bu kapsül formasyonu görülmez.
B-Boyama
Kolonilerden yapılan boyamalarda B. anthracis saç gibi uzun ve birbirine paralele flamentler meydana getirir. Basiller içinde sporlar görülür.
C-Hareket
B. anthracis hareketsizdir.
D-Penisilin duyarlılığı
B. anthracis penisiline duyarlıdır.
E-Bakteriyofaj duyarlılığı
gama-fajı sadece B. anthracis’ e spesifik yani tür spesifik bir fajdır. Katı besiyerinin tüm yüzeyine B. anthracis yayıldıktan sonra, üzerine bir damla -fajı damlatılır ve inkubasyona bırakılır. İnkubasyon süresi sonunda fajın damlatıldığı yerde üremenin inhibe olduğu gözlenir.
F- Biyokimyasal testler: Gerekirse diğer biyokimyasal testlerden de yararlanılabilir. ( Katalaz, nitrat redüksüyonu gibi)
3-Hayvan Deneyi:
Marazi maddeden ya da şüpheli kolonilerden hazırlanan inokulumlardan, fare ya da kobaylara deri altı/intraperitonal yolla inokulasyon yapılır. Hayvanlar 2-7 gün içerisinde ölürler. Otopsi bulguları olarak deri altında ödem, septisemi tablosu ve dalakta büyüme göze çarpar. Dalaktan hazırlanan frotilerden Gram boyama sonucu Gram pozitif basiller, Giemsa boyama sonucu da kapsüllü bakteriler görülür. Ayrıca ekim yapılarak etkenin izolasyonu ve ientifikasyonu yapılır.
4-Serolojik Testler:
Presipitasyon testleri, ELISA, İmmunoflouresans tekniği (IFA), Indirek mikrohemaglutinasyon (IMHA) testleri yapılabilir. Ascoli termo presipitasyon testi, aşılı hayvanlarda da pozitif sonuç vermesi nedeniyle ülkemizde artık kullanılmamaktadır. IFA’ nın spesifitesi düşüktür, B. cereus ve B. megatherium ile kross reaksiyonlar görülebilir. IMHA testinin AGP’ ye oranla daha duyarlı ve hızlı bir test olduğu saptanmıştır. ELISA ile antikor titresini saptanabilmektedir. Ancak hayvanlarda anthraxın tanısında serolojik testler çok başvural yöntemler değildir ve standart metod olarak kabul edilen bir yöntem bulunmamaktadır.

[Yazar]

Yazılar